Teknik-teknik Penopang Bioteknologi

•       Gel elektroforesis

•       Agarose gel elektroforesis

•       Polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE)

•       Southern blot

•       PCR

•       Kultur sel/Bioreaktor

•       Agarose Elektroforesis

•       Istilah yang digunakan untuk menjelaskan pergerakan ion-ion dalam suatu medan beraliran listrik

•       DNA merupakan molekul yang bermuatan negatif.

•       DNA bermigrasi dalam media gel agarose menuju anode pada laju/kecepatan molekul yang kecil mendahului yang berukuran lebih besar, sehingga terbentuk fragmen-fragmen

•         Agarose Elektroforesis

•       Elektroforesis terhadap plasmid DNA biasanya dilakukan dengan gel agarose yang direndam dalam bufer elektroforesis

•       Konsentrasi agarose yang digunakan disesuaikan berdasarkan ukuran molekul DNA yang akan diukur/diuraikan, misalnya: 0.3% w/v untuk fragmen DNA > 20.000bp; 0.8% untuk <20.000 bp

•       PAGE

•       Untuk fragmen DNA dengan ukuran sangat kecil, penguraian dilakukan dengan menggunakan PAGE

•       Digunakan pula untuk melakukan sekuensing gen (pengurutan pb)

•       Sekuensing yang paling umum: Metode Sanger (chain termination)

•       Menggunakan dideoxynucleotide (tanpa gugus –OH) baik pada posisi C-2 maupun C-3

•       Prinsip: Metode Sanger (chain termination)

•       Menggunakan dideoxynucleotide (ddNT-tanpa gugus –OH) baik pada posisi C-2 maupun C-3

•       Terhadap rantai DNA yang ‘tumbuh’, ditambahkan ddNTP

•       Karena ddNTP tidak mengandung –OH pada posisi C-3 maka tidak akan terbentuk ikatan phosphodiester dengan dNTP yang datang pada rantai DNA yang sedang tumbuh

•       Contoh: Metode Sanger (chain termination)

•       DNA yang akan dianalisa (template)

•       DNA polymerase (Taq)

•       Primer oligonucleotide yang diketahui sekuen nya

•       dGTP, dATP, dCTP, dTTP (jumlah/konsentrasi berlebih)

•       Salah satu dari ddGTP, ddATP, ddCTP, atau ddTTP (jumlah/konsentrasi tertentu)

•       Contoh: Metode Sanger (chain termination)

•       Untai DNA baru disintesis dengan menambahkan dNTPs pada primer

•       Reaksi ,dipandu’ oleh template sampai saat ddNTP ditambahkan

•       Selama ddNTP belum ditambahkan, sintesis DNA akan terus berlangsung, tetapi setelah penambahan, terjadi kompetisi, saat ddNTP masuk dalam reaksi, maka ‘pertumbuhan’ rantai DNA akan terhenti

•       Contoh: Metode Sanger (chain termination)

•       Setelah direaksikan pada suhu tertentu dan bufer tertentu (formammide, 80’C)

•       Fragmen DNA dianalisa menggunakan PAGE

•       Dilakukan pembacaan (Manual/Komputer)

•       Southern Blot

•       Hasil fragmentasi DNA menggunakan agarose gel, fragmen tsb dapat didenaturasi dan ‘dipindahkan’ dibuat statis pada suatu membran

•       Teknik pemindahan ini dikembangkan pertama kali oleh E.M. Southern

•       Prinsip:

•       Gel direndam dalam bufer (basa) untuk mendenaturasi dsDNA à ssDNA

•       Dinetralkan kemudian di letakan pada mebran nitroselulose

•       Southern Blot

•       Prinsip:

•       Gel direndam dalam bufer (basa) untuk mendenaturasi dsDNA à ssDNA

•       Dinetralkan kemudian di letakan pada mebran nitroselulose

•       Membran dipanasakan 80’C

•       Dilabel menggunakan probe ssDNA

•       Northern blotting (RNA)

Teknik-teknik Penopang Bioteknologi

•       Gel elektroforesis

•       Agarose gel elektroforesis

•       Polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE)

•       Southern blot

•       PCR

•       Kultur sel/Bioreaktor

•       PCR (polymerase chain reaction)

•       PCR sangat berbeda dengan kloning gen

•       Kloningà manipulasi yang melibatkan sel-sel hidup

•       PCRà manipulasi dilakukan pada sebuah tabung reaksi mikro. DNA dicampur satu set reagensia kemudian tabung ditempatkan pada suatu alat pemanas ‘thermocycler’ yang suhu dan siklusnya bisa diatur/dikontrol

•       Inventor: Kary Mullis (1985)

•       Reaksi dasar

•       PCR melibatkan 2 primer oligo nukleotida (molekul DNA untai tunggal sintetik, berukuran pendek:17-30 nt)

•       Primer-2 tsb menghibrid untaian DNA dalam arah berlawanan, setelah DNA tsb didenaturasi, sehingga DNA disintesis oleh polimerase sepanjang wilayah antara ke dua primer tersebut

•       Hasil reaksinya adalah terbentuknya dua DNA untai ganda

•       Jika reaksi diulang kembali akan terbentuk lagi DNA untai ganda dst.

•       Secara teori, setelah 22 siklus akan terbetuk 10⁶ molekul DNA untai ganda

•       Tahapan dasar

•       Materi PCR dicampur dalam satu micro tube

•       Dipanaskan 94’C: ikatan-2 hidrogen yang menautkan untaian ganda DNA terurai (denaturasi)

•       Campuran didinginkan 50-60’C: untaian akan bergabung lagi; tetapi hal umumnya ini tidak terjadi karena campuran reaksi mengandung primer dalam jumlah berlebih; primer-2 ini akan menempel (annealing) pada molekul-2 DNA untai tunggal tsb.pada posisi tertentu untuk proses sintesis DNA “baru”

•       Tahapan dasar

•       Suhu dinaikkan ke 74’C. Ini adalah suhu optimum bagi enzim Taq (Thermus aquaticus) Polymerase untuk bekerja

•       Taq polymerase menempel pada salah satu ujung primer dan mensintesis untaian-untaian DNA baru yang komplementer dengan cetak (template) DNA target à satu siklus, terbentuk 2¹.

•       Masuk siklus berikutnya dst (2ⁿ)

•       Perhitungan dasar

•       Primer:

•       17-30nt

•        

•       Tris-HCl pH 8.3

•       MgCl

•       dATP, dCTP, dGTP, dTTP

•       Taq DNA polymerase